干货 | 疑难样本解离之软骨与骨组织
软骨和骨是人体的支架结构，来源于胚胎时期的间充质。软骨和骨的主体分别是软骨组织和骨组织，他们皆属于高度特化的固态结缔组织，其中骨组织的硬度又大大超过软骨组织。
解剖结构
软骨（cartilage）由软骨组织及包裹它的软骨膜构成。软骨组织由软骨细胞和软骨基质构成。软骨根据基质中所含纤维不同可分为三大类：
1.透明软骨（hyaline cartilage）
因新鲜时呈半透明而得名，分布较广，包括肋软骨、关节软骨、呼吸软骨等，纤维交织排列成三维网格状，基质中含水分较多。
2.弹性软骨（elastic cartilage）
分布于耳廓、咽喉及会厌处，新鲜时呈黄色，组织结构与透明软骨相似，但纤维成分为大量交织排列的弹性纤维。
3.纤维软骨（fibrous cartilage）
分布于椎间盘、关节盘和耻骨联合等处，呈不透明的乳白色，由大量粗大的胶原纤维平行或交叉排列，具有很强的韧性，软骨细胞小而少的分布在纤维束之间。
骨是由骨组织、骨膜和骨髓等构成的坚硬器官，骨中含大量钙、磷等矿物质，骨组织（osseous tissue）是骨的结构主体，主要由骨细胞和骨基质（bone matrix）组成，由于有大量骨盐（bone salt）沉积，使得骨组织非常坚硬。
1、骨基质
骨基质：简称骨质，即骨组织中钙化的细胞外基质，包括有机成分和无机成分，含水极少。胶原纤维总量约占有机成分的90%，无机成分又称骨盐，占干骨重量的65%。其结构经历了由编织骨（woven bone）转变为板层骨（lamellar bone）的过程。
A、密质骨
在长骨骨干、扁骨和短骨表层、骨板层数多、排列规则，所有骨板紧密结合，程密质骨。
B、松质骨
在长骨骨骺和骨干内表面、扁骨的板障和短骨中心等处，数层骨板形成大量针状或片状骨小梁（bone trabecula），搭建成有较大空隙的立体网格样结构，肉眼可见骨质呈“疏松状”，故称为松质骨。
2、骨组织的细胞
A、骨祖细胞（osteoprogenitor cell）
是软骨组织和骨组织共同的干细胞，位于软骨膜和骨膜内层。细胞呈梭形，胞体小，胞质少，核小色深。
B、成骨细胞（osteoblast）
分布在骨组织表面，常单层排列，矮柱状或不规则形。
C、骨细胞（osteocyte）
是位于骨组织内部有多个细长突起的细胞，比较均匀地分散于骨板之间或骨板内，由成骨细胞转变而成。
D、破骨细胞（osteoclast）
是一种可游走的多核巨细胞，直径30~100μm，一般认为由多个单核细胞融合而成，散在分布于骨组织表面、形态不规则，细胞核6-50个不等，含丰富的溶酶体和线粒体。
解离难点
构成软骨与硬骨的细胞外基质不同：软骨细胞外基质主要是胶状和纤维物质等，使其富有弹性和韧性；而骨细胞外基质主要是沉积的骨盐，使其质地坚硬；两者之间的差别使得需采用不同的酶解离液以及酶解方式。软骨组织在取样时，尽量避免取到骨组织部分，骨组织的存在会使细胞悬液的杂质增多，从而影响最终的细胞悬液质量。
软骨组织示意图
骨组织示意图
解离案例展示
人_软骨
一、解离流程
二、解离方法
1.预处理：用预冷的HBSS将软骨组织清洗干净并称重，将组织尽量剪碎至颗粒状，转移至含有【软骨专用解离液】的15mL离心管中；
2. 组织消化：37℃水浴消化100-120min，每15min温和颠倒混匀，每30min收集一次上清并终止消化于冰上暂存；
3. 阶段收集：收集3-4轮细胞悬液，用70μm滤网过滤，350g，5min离心收集，弃上清，重悬细胞沉淀；
4. 定容清洗：用DMEM重悬沉淀，定容至10mL，300g离心5min，弃上清；
5. 镜检计数：用荧光细胞分析仪对细胞悬液进行质控并稀释至合适的浓度上机捕获。※ 可选步骤：若过滤后镜检发现细胞悬液中有红细胞，则需进行裂红处理。
三、结果展示
1.重悬
2.UMAP图
一、解离流程
二、解离方法
1. 预处理：取小鼠股骨，剪去两端骨骺，使用一次性医用注射器将股骨中的骨髓冲出，将组织纵劈，用预冷的HBSS清洗并称重；
2. 初步消化：使用【增强解离液】水浴20min，此步骤收集的大部分为髓系细胞，可舍弃；
3. 阶段消化：使用【骨组织专用解离液】水浴30min，收集细胞悬液，加入2倍体积的终止消化液，于冰上暂存；
4. 重复步骤3，收集悬液共计3-4轮，直至没有大量的细胞出现；
5. 过滤收集：用70μm滤网过滤收集所有单细胞悬液，350g，5min，弃上清；
6. 定容清洗：用DMEM重悬沉淀，定容至10mL，300g离心5min，弃上清；
7. 镜检计数：用荧光细胞分析仪对细胞悬液进行质控并稀释至合适的浓度上机捕获。
※ 可选步骤：若过滤后镜检发现细胞悬液中有红细胞，则需进行裂红处理。
三、结果展示
1.重悬
2.UMAP图
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